Por: Dr. Esteban Morales van Kwartel  D.T.M&H; D.Prev.Med; McommH; M.H.Econ.

 

Introducción

 

El informe Corman-Drosten fue una sustentación, según sus creadores, de la validez del protocolo y validación de este, basado en la técnica RT-qPCR como prueba diagnóstica para SARS CoV2, que fueron desarrollados por científicos europeos. Este proceso diagnóstico fue aceptado como estándar de oro a pesar de sus limitaciones, algunas de las cuales fueron aceptadas por los propios autores, tal como podemos ver en la introducción del informe(1), en la página 23. Una limitación importante fue que los aislamientos del virus o las muestras de pacientes no habían estado disponibles; otra fue que el diseño y la validación de la prueba se hicieron usando la relación genética con el SARS-CoV de 2003 y ayudados por el uso de tecnología de ácido nucleico sintético. Esto solo, de por sí, tiene grandes repercusiones en la eficacia de los resultados pues hace que el protocolo que diseñaron para la detección y confirmación específica de 2019-nCoV (como se llamaba al virus en ese momento, y llamado después SARS CoV-2), en ausencia de aislamientos de virus disponibles o muestras originales de pacientes, sea deficiente tanto para la prueba misma como para la validación de los componentes del proceso. Estas limitaciones, de tremenda importancia, no fueron las únicas; hubo muchas otras que fueron reveladas por numerosos autores, biólogos moleculares, epidemiólogos, etc., que trataremos de resumir a continuación.

Cabe mencionar primero, lo que el fallecido creador de la prueba de PCR, el bioquímico Kary Mullis, con la autoridad que le confería la autoría de esta prueba, confirmado por la adjudicación del premio Nobel por esto, había comentado sobre la prueba. Esto ha sido motivo de mucha controversia pues algunas cosas fueron adjudicadas erróneamente a el y otras que, si dijo, fueron manipuladas de manera poco científica. Nosotros nos tomamos el trabajo de localizar los videos en los que el Dr. Mullis se refirió a esto. Lo que sí dijo, por ejemplo, fue(2): La prueba de PCR no es mal usada, lo que si es que es malinterpretada…con la PCR, si lo haces bien, puedes encontrar casi cualquier cosa en cualquiera.

Esto, de hecho, es epidemiología pura y lo explicaremos más adelante. Lo que sI dijo también es(3): la prueba te dice qué es lo que hay en el sujeto. Te permite tomar una cantidad minúscula de algo y hacerlo medible y luego dices que es importante; esto no es un mal uso de la prueba, sino mala interpretación… [La PCR es] solo un proceso que se usa para hacer mucho de algo. Eso es lo que es. No te dice que estás enfermo, no te dice que lo que has terminado teniendo realmente te iba a lastimar o algo así. El Dr. Mullis habló extensamente sobre este tema, usando un raciocinio genial que afortunadamente quedaron plasmados para la posteridad, por lo que hemos querido compartirlo en la siguiente referencia(4)

Las palabras del Dr. Mullis han sido aplicadas, por todos los que conocemos de virología e inmunología, a la relación entre el coronavirus y la prueba de PCR. Aunque los famosos autodenominados “fact chequers” no se atrevieron a difamar al autor, ganador del premio Nobel, sí han atacado con gran intensidad a los que han defendido esta interpretación, basándose en el hecho de que esto solo se aplicaba específicamente al VIH(5). Esto, sin embargo, es absurdo pues el principio en que se basó su afirmación se puede referir a cualquier agente infeccioso. Y, en efecto, sí se refería al VIH pues, desafortunadamente, el Dr. Mullis murió en 2019, poco antes de que el mundo conociera la existencia del SARS CoV 2, por lo que la humanidad no pudo seguir gozando de su brillantez y agudeza mental y sus cuestionamientos inteligentes y llenos de sentido común, a los paradigmas cuasi religiosos dados por la autodenominada élite del pensamiento científico.

Todos los biólogos moleculares y médicos y, especialmente, epidemiólogos responsables saben que esta generalización es cierta. La prueba de RT-qPCR técnicamente no puede verificar la infectividad de un patógeno detectado, como, por ejemplo, un virus; por lo tanto, no puede identificar una persona contagiosa, ni diagnosticar una enfermedad. La tecnología PCR simplemente amplifica cualquier material genético de interés; es decir, pequeñas partes de un genoma viral como el del SARS-CoV-2, independientemente de si es una partícula inerte o no(6,7). Sobre los aspectos epidemiológicos, tanto de la prueba en general como del protocolo evaluado, nos vamos a referir al final con mayor profundidad por ser nuestra área de trabajo. Sobre el aspecto técnico- biológico de estos, nos referiremos, en primer lugar, muy brevemente, por ser eso del campo de los biólogos moleculares. Para eso nos valdremos de varios trabajos presentados por prestigiosos profesionales de la materia que iremos citando oportunamente.

Análisis técnico-biológico

 La lectura del protocolo Charité de los europeos nos reveló serias limitaciones. Los autores, en la parte introductoria de su protocolo, tal como ya hemos citado, se refieren al hecho de que no tenían disponible el virus vivo. De hecho, en el momento del diseño de su prueba diagnóstica y aún en la fecha de su publicación, no se habían presentado casos de Covid-19 en Europa(8). Esto fue usado como justificación para incluir en su manuscrito, tal como aparece en la página 24 de la introducción, lo siguiente(1): Nuestro objetivo fue desarrollar e implementar una metodología de diagnóstico sólida para su uso en entornos de laboratorio de salud pública sin tener material de virus disponible… aquí presentamos un flujo de trabajo de diagnóstico validado para 2019-nCoV; su diseño se basa en la estrecha relación genética de 2019-nCoV con SARS coronavirus, haciendo uso de la tecnología de ácido nucleico sintético. Las implicaciones de esto, en la validez de la prueba, fueron destacadas en los análisis realizados por varios autores; a esto nos referiremos más adelante.

Seguidamente, los autores del informe Corman-Drosten indican que las muestras del SARS CoV-1  se obtuvieron durante 2019, de pacientes hospitalizados en el centro médico Charité de Berlín. De allí el nombre dado a esta prueba diagnóstica. Ellos partieron entonces del supuesto de que la reactividad cruzada prevista de todos los ensayos con ARN viral del SARS-CoV les permitiría detectar el SARS CoV-2 sin tener que depender de fuentes externas de ARN 2019-nCoV específico(1). Esta deficiencia, de enorme importancia, la explicaremos más adelante. Estos nos siguen diciendo (p. 24 del informe) que la selección de los primers (cebadores) y los probes (sondas genéticas) se establecieron en base a la secuencia viral obtenida online en el sitio web del GISAID, donde había sido colocada por los chinos(1,9), lo cual indica que se basaron en una secuencia teórica. 

Dos de las cosas más crítica en el diseño de estas pruebas diagnósticas son la confección y escogencia de los primers y los probes. Un primer, en español conocido como cebador o iniciador, es un fragmento corto de ADN utilizado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se hibridan con el ADN de la muestra (target) y acotan la región que se amplificará, generando millones de copias en un período de tiempo muy breve(10).  Una sonda genética, conocida también como sonda de ADN o sonda de ácido nucleico, conocida en inglés como probe, es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para encontrar su secuencia complementaria en el genoma de una muestra(11). Pues bien, Los primers o cebadores se adhieren a los genes de interés o targets e inician el proceso de la prueba. Para esto se requiere que tanto los primers como los genes presentes sean específicos del componente genético del virus que buscamos. Pero ya habíamos mencionado antes que, en su propio protocolo, los autores indicaron que habían utilizado una cepa de SARS CoV 1. Específicamente estas fueron muestras de la cepa Frankfurt-1 en los cuales se identificaron 3 genes como targets: el gen E, el gen RdRp y el gen N. A este último no se le realizaron validaciones posteriores, pues, según ellos, era menos sensitivo (ver páginas 25 y 26 del informe)(1).

Lo descrito hasta ahora fueron algunos de los elementos importantes que dieron lugar a las numerosas críticas técnico-biológicas de este diseño, realizadas por prestigiosos biólogos moleculares, algunas de las cuales, que consideramos más críticas, trataremos de resumir. Pieter Borger(12) Experto en biología molecular de la expresión génica, comunicó a través de las redes sociales que, en noviembre de 2020, había presentado una solicitud a Eurosurveillance para que se refractara del documento de Cormann-Drosten, pues se publicó sin una revisión por pares. Al mismo tiempo solicitó que se publicara su crítica del documento, lo cual fue rechazado(13). Hasta la fecha nunca han sido presentados los estudios de pares, si es que fueron realizados. De hecho, en el mismo documento publicado, se informa que este fue presentado para publicación el 21 de enero 2020; aceptado el 22 de enero y publicado en Euroservilliance el 23 de enero de 2020. esto hace virtualmente difícil que se hubiesen realizado estudios de pares antes de su publicación.

En enero 2020, ante la falta de respuesta, el Dr. Borger y colaboradores, presentan un estudio donde se describen 10 grandes defectos científicos a nivel molecular y metodológico(14). Nos basaremos en este documento y otros más para explicar las repercusiones de lo que encontramos en la lectura del protocolo Charité. En los siguientes párrafos, describo solo una parte de los 10 grandes defectos científicos que el grupo del Dr. Borger describe en su análisis del documento de los europeos. Yo voy a centrarme en los defectos que mayormente llevan a la principal crítica que han tenido estas pruebas que han sido avaladas y promovidas por la Organización Mundial de la Salud (OMS); esta es, la existencia de gran cantidad de FALSOS POSITIVOS. En este sentido, los dos principales aspectos productores de estos falsos positivos son la reducida efectividad de la prueba y la falta de especificidad de esta.

Según Borger y col., esto es causado por la falta de una validación correcta de la prueba antes de su aplicación; esto se debió a la falta de material vivo disponible, tal como aparece en la descripción del protocolo y que habíamos resaltado en párrafos anteriores. Como se muestra en el protocolo Charité, la validación solo se realizó con respecto a las secuencias in silico (teóricas) y dentro del entorno de laboratorio. Borger resalta que una validación apropiada es un requisito para el diagnóstico in vitro y esta debe hacerse con ARN viral genómico aislado, previo a la aplicación de la muestra en las personas. Nos dice, además, que la falta de material vivo los llevo a un diseño que solo se basa en parientes genéticos cercanos; esto no cumple con el objetivo de una “prueba de diagnóstico sólida” que evite aspectos de reactividad cruzada; por lo tanto, inevitablemente, se producirán resultados falsos positivos. Pero la falta de material vivo disponible no solo da lugar a esta deficiencia, sino que esto les impide la determinación crítica de la carga viral lo cual es información obligatoria.

El otro aspecto de fundamental importancia para garantizar la disminución de falsos positivos, en función de la efectividad y especificidad, es el tema de los cebadores (primers) y las sondas (probes), a los que nos hemos referido en párrafos anteriores y que están directamente relacionados a la eficacia. Una prueba de diagnóstico sólida debe ser específica para el gen objetivo que se desea amplificar. En el documento de Corman-Drosten se describen seis posiciones no especificadas; en su estudio, Borger y col., explican que esto causa una gran deficiencia debido a que este número de variantes produce una gran confusión en los laboratorios, puesto que estas seis posiciones no especificadas podrían resultar fácilmente en el diseño de varias secuencias de cebadores (primers) que posean alternativas diferentes que no se relacionan con el SARS-CoV-2

La lectura del documento de Corman-Drosten, que citamos al principio, nos señala que, aunque aquí se describen 3 cebadores, estos solo cubren aproximadamente la mitad del genoma del virus. Este es otro factor que, de acuerdo con el estudio citado, disminuye la especificidad para la detección del ARN intacto del virus COVID-19, especialmente porque se disponía solo de un virus pariente y no del virus de interés. Esto aumenta la probabilidad de la presentación de falsos positivos en el uso de la prueba. Otros autores, además del que estamos citando, demostraron también serias deficiencias en los primers (cebadores) y probes (sondas), en especial a los relacionados al gen E, y el gen RdRp(15); Aquí los autores también se refieren a las posiciones no especificadas, lo cual, según ellos, puede generar amplificación accidental de PCR, incluso en ausencia de secuencias de SARS-CoV-2. En cuanto al segundo gen (gen RdRp), Pillonel encontró que el cebador inverso RdRp propuesto, contenía una base degenerada (S) incorrecta que no coincide con la secuencia de ARN del SARS-CoV-2; menciona también la posibilidad de la presentación de falsos positivos en los ensayos con el gen E(16).  

El uso de cebadores, sondas y targets inapropiados fue la característica del protocolo de los europeos a pesar de que los chinos ya venían trabajando en sus propios protocolos donde advertían la inconveniencia del uso de estos y recomendaban otros tantos. Desde diciembre 2019, los chinos detectaron y aislaron el virus a partir de pacientes infectados; usando técnicas moleculares; habían secuenciado el ADN, descubriendo un nuevo beta coronavirus que denominaron inicialmente, 2019-nCoV. Sobre la base del análisis de tres genomas completos obtenidos en su estudio, diseñaron varios ensayos específicos y sensibles (uso de sondas específicas), dirigidos a las regiones ORF1ab, N y E del genoma 2019-nCoV para detectar ARN viral en muestras clínicas(17). Esta información, al igual que los conjuntos de cebadores y los procedimientos operativos estándar, se habían estado compartiendo con la OMS.  

La lectura de los informes de los diversos ensayos moleculares realizados por los chinos, nos indican los siguientes aspectos que difieren totalmente del protocolo Charité(18,19):

• Se utilizaron secuencias reales a partir de virus de SARS-CoV-2 aislados de pacientes, con lo que el diseño y la validación de las pruebas se hicieron usando la relación genética con el SARS-CoV-2, y ayudados por el uso de tecnología de ácido nucleico real, no sintético.
• Los targets utilizados fueron específicos a los componentes del virus SARS-CoV-2, produciéndose una vinculación directa con este. Estos fueron: el marco de lectura abierto 1ab (ORF1ab) y la proteína nucleocápside (N)
• Estos se analizaron y probaron simultáneamente durante el ensayo RT-PCR en tiempo real. 
• Ninguno de los cebadores utilizados, a saber, los cebadores positivos, ni los cebadores inversos de ninguno de los dos genes, tenían posiciones inespecíficas, por lo que la especificidad y la sensibilidad eran altas.
• Lo mismo se daba para el caso de las sondas utilizadas, las cuales, además, a diferencia de las utilizadas en el protocolo Charité, llevaban una secuencia correcta y completa de la partícula, mejorando también, de esta manera, la sensibilidad y especificad de la prueba.

Toda la información específica sobre los cebadores y sondas recomendadas fueron publicadas en un documento especial por los chinos(20). En su protocolo estos no recomendaron el uso del gen E que si fue usado en el protocolo europeo. El documento se encuentra en chino, pero se puede traducir en google. 

Cabe resaltar que los chinos han continuado sus investigaciones para mejorar la eficacia de estas pruebas moleculares. En un trabajo realizado por científicos de varias universidades chinas, confirmaron in vitro que los ensayos con el gen RdRp-P2, que es el usado por los europeos, tiene un bajísimo límite de detección (28.2%) y reacciona de forma cruzada con el SARS-CoV en cultivo celular. Sin embargo, los ensayos dirigidos a la ARN polimerasa (RdRp)/helicasa (Hel) dependiente del ARN, tienen un mayor límite de detección (43.6%) y no reacciona de forma cruzada con otros coronavirus patógenos humanos y otros patógenos respiratorios, en cultivo celular y muestras clínicas(21). Existen, además, otros trabajos en donde se mejora notablemente la eficiencia de la prueba, utilizando cebadores y sondas mejor diseñados, y genes target que poseen muchísima más especificidad(22). Esto da margen a que el protocolo europeo podría ser mejorado, cosa que no se ha hecho hasta el momento.

Lo más difícil de comprender en todo esto, es la razón por la cual los europeos, sabiendo que los chinos estaban trabajando desde el principio en el desarrollo de sus protocolos y creación de los cebadores y sondas apropiadas, obtenidas a partir de virus específicos reales, que  estaban siendo validadas correctamente y que, en los ensayos moleculares se utilizaban ácidos nucleicos reales y no sintéticos, se precipitaron a sacar su propio protocolo que, según las fechas registradas en los informes, se publicaron 1 o 2 días antes de la publicación oficial del protocolo de los chinos. Por otro lado, es difícil entender la razón por la cual los europeos utilizaron targets diferentes a los utilizados por los chinos, que eran de comprobada sensibilidad. 

Pero más aún, no se entiende por qué dejaron de recomendar el uso del gen N, aludiendo a argumentos sobre baja sensibilidad de este, cuando los chinos lo utilizaban con éxito, y que hay estudios que comprueban que este es, precisamente, el de más alta sensibilidad(23). Este gen (N), tal como se observa en la siguiente referencia(24), comenzó a ser utilizado en el primer protocolo europeo; sin embargo, en la primera revisión del protocolo, realizada unas semanas después de su publicación, dejó de ser recomendado para su uso tal como se muestra en las páginas 25 y 26 de la siguiente referencia(1). La única razón que se me ocurre es que fue producido por la soberbia de querer mostrarse como los más eficientes y poseedores de una mente científica privilegiada. Pero la soberbia tiene sus consecuencias; desafortunadamente, estas las sufrieron una gran porción de la humanidad. 

No quisiera pensar que hubiese otra razón, pues no quiero entrar en un campo que podría ser considerado como una teoría de la conspiración. Hubo muchos otros defectos relacionados con los cebadores y sondas, y la falta de espécimen de interés vivo. Aquí mencionamos solo algunos, pero en términos generales, el virus de interés debe estar disponible para demostrar la especificidad y sensibilidad del diseño de la prueba. Esto no fue abordado en el protocolo Charite. Es esencial que los cebadores sean 100% específicos para el objetivo de interés a fin de evitar la reactividad cruzada con secuencias de genes estrechamente relacionados y, por lo tanto, variantes del virus. Esto no se dio en el protocolo Charité. 

Análisis de la epidemiología molecular

Lo analizado en la sección anterior es solo una parte minúscula de las fallas técnico-biológicas del protocolo Charité. Entremos a analizar la parte epidemiológica de estas fallas. En esta sección enfatizaremos más en la epidemiología molecular y en la siguiente sección discutiremos aspectos relacionados a la epidemiología general. La precisión de la prueba molecular de diagnóstico del SARS-CoV-2 ha sido limitada y, a veces, controvertida. Pero a pesar de esto, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR) fue considerada el estándar de oro para el diagnóstico y la detección de COVID-19(25). Sin embargo, en un documento publicado en el sitio web oficial del gobierno de Estados Unidos, a inicios del año 2022 (26), se expresa la preocupación por la limitada precisión y las controversias generadas por esta prueba. 

Pero además de lo anterior, el mismo documento revela que se siguen presentando las mismas anomalías del protocolo Charité, señaladas en este artículo. Estas anomalías son compartidas por la mayoría de los otros protocolos, con la excepción del de los chinos y el más reciente de los Estados Unidos. Los resultados de estas pruebas pueden dar positivo persistentemente, indicando con esto, solo la existencia de partículas virales inertes, o bien, la presencia del virus, pero que no necesariamente es transmisible o infeccioso o con capacidad de replicación. En otras palabras, un individuo con un resultado positivo no significa que está enfermo, ni que puede transmitir eficazmente el virus(27,28).

Es muy importante aquí retomar por un momento la apreciación que tenía el Dr. Karis Mullis en cuanto a los abusos sufridos por la prueba de PCR de su creación, discutidas anteriormente en este artículo. El defendía la calidad y el valor de esta, pero advertía vehementemente sobre la mala interpretación que se hacía frecuentemente de los resultados de esta. El enfatizaba en la necesidad de considerar la existencia o no de síntomas de la enfermedad causada por el agente infeccioso buscado; es decir, la apropiada combinación de la clínica y la epidemiología de la enfermedad. Esto fue ignorado frecuentemente, no solo a lo largo de la pandemia, sino en otras ocasiones anteriores, a pesar de que las propias normas de la OMS establecen en la pág. 9 de su documento de consenso sobre la epidemiología del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), la necesidad de esta vinculación de datos(29).

En efecto, las pruebas de PCR dirigidas a la investigación clínica se basan en la sensibilidad de esta para confirmar o disminuir una sospecha de infección en un individuo sintomático; mientras que, cuando son dirigidas a la investigación epidemiológica, apuntan a la detección específica de individuos verdaderamente infecciosos, que son capaces de propagar la infección viral. En este contexto, los resultados no pueden nunca reemplazar un diagnóstico médico completo, dada la existencia de las múltiples características del paciente; es decir, síntomas, antecedentes de contacto, comorbilidades, historial de medicamentos, edad, etc. Aquí, el valor del “Ct” de la prueba, sobre el que hablaremos a continuación, tiene también su papel. Esta afirmación está relacionada a varios aspectos de la epidemiologia molecular. El primero de ellos que queremos analizar es lo referente al valor Ct de la prueba. Esto es lo que se conoce como el “umbral de ciclos” o cycle threshold (Ct). Este es un concepto fundamental para la interpretación correcta de los resultados de los ensayos de RT-qPCR por lo que lo explicaremos brevemente. 

En un ensayo de PCR en tiempo real se detecta una reacción positiva por acumulación de una señal fluorescente. El Ct (umbral de ciclo) se define como el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente cruce el umbral (es decir, excede el nivel base)(30). Los niveles de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico objetivo (target) en la muestra; es decir, cuanto menor sea el nivel de Ct, mayor será la cantidad de ácido nucleico objetivo en la muestra)(31). Jefferson y col.(32), en un estudio publicado por la Oxford University Press, encontraron que los virus vivos completos son necesarios para la transmisión; no así, los fragmentos identificados por PCR. Las pruebas de rutina prospectivas de muestras de referencia y cultivo y su relación con los síntomas, los signos y los cofactores de los pacientes, deben utilizarse a fin de definir la fiabilidad de la PCR para evaluar el potencial infeccioso. Ellos afirmaron también que es poco probable que aquellos con un umbral de ciclo alto (Ct) tengan potencial infeccioso.

En su estudio, los autores concluyen que las pruebas de Ct son muchas veces difíciles de interpretar en ausencia de la historia clínica y el contexto. Por ejemplo, resultados positivos se pueden ver cuando hay carga viral baja (Ct alta) en las primeras etapas de la infección cuando la persona no puede transmitir la infección; o bien, se pueden ver al final de la infección, cuando el riesgo de transmisión es bajo. Los Ct dan resultados específicos y concretos, pero pueden caer en una zona indeterminada que requiere la realización de pruebas de seguimiento, cosa que, muchas veces, no se está en condiciones de realizar y por otro lado, muchos laboratorios carecen de la información clínica del paciente, especialmente cuando se toman muestras masivas. Esto enfatiza la importancia de la realización de las pruebas de validación de los Ct, y que, tal como mencionamos con anterioridad, desconocemos si fueron realmente realizadas o no, puesto que los resultados de estas no aparecen en el protocolo Charité. Existen unas normas generales, producto de las investigaciones y de la práctica en los laboratorios. En términos generales, sus valores e interpretación los presentamos en la siguiente nota al pie^[1]. Una revisión sistemática realizada por Jefferson y col., sugiere que hay una relación entre carga viral, umbral de ciclos e infectividad(33). Una vez dicho todo esto, es importante saber que la determinación de este valor Ct en que se puede considerar, con bastante probabilidad, una muestra como positiva, puede variar. Esto 

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^[1]  

• Cts < 29 son reacciones positivas fuertes indicativas de ácido nucleico objetivo abundante en la muestra. 
• Cts de 30-37 son reacciones positivas indicativas de cantidades moderadas de ácido nucleico objetivo.
• Los Cts de 38-40 son reacciones débiles indicativas de cantidades mínimas de ácido nucleico objetivo que podrían representar un estado de infección o contaminación ambiental.

Consultado en: https://www.wvdl.wisc.edu/wp-content/uploads/2013/01/WVDL.Info_.PCR_Ct_Values1.pdf

depende de varios factores, tales como las inherentes a las condiciones de cada laboratorio, la toma de las muestras, etc., así como también, de las características de los cebadores y las sondas utilizadas en el proceso de amplificación. En este proceso se genera una señal de fluorescencia que a su vez da el valor de Ct el cual tiene que ser verificado. Como consecuencia de esto, cada laboratorio, en especial si se usa un nuevo protocolo, debe realizar un análisis de secuenciación in vitro para confirmar la secuencia amplificada(34). Este análisis se denomina secuenciación de Sanger(6); esta validación es lo que va a marcar el umbral de ciclos que consideran definitorio de la alta o baja carga viral. Pues bien, la lectura del protocolo de charité, cuyo análisis estamos realizando, nos muestra que los autores de este no incluyeron este importante paso de confirmación. Por lo tanto, nunca se ha demostrado la especificidad de los cebadores y sondas utilizados en este protocolo para producir una amplificación confiable, específica del objetivo (target), lo cual se puede traducir en la generación de resultados falsamente positivos, e incluso, falsamente negativos. Este solo detalle debiera haber bastado para que un estudio de pares serio hubiese descalificado este protocolo.

El protocolo de los chinos, con el cual estamos comparando el protocolo Charité de los europeos, tiene incluida esta prueba de confirmación lo cual estableció un criterio claro y definido para la interpretación de los resultados de las pruebas con respecto a los Ct; este lo pueden encontrar en la siguiente nota al pie de página, en donde transcribimos la traducción al español que hicimos de la Interpretación del resultado de esta prueba^[1]. El tema de la correcta interpretación de los resultados de las pruebas de PCR y su debida correlación con la clínica del paciente nos lleva al siguiente aspecto; este es el relacionado a lo conocido como la “diseminación o extracción viral” (viral shedding)(35)lo cual afecta grandemente la interpretación del resultado de la prueba. Sucede que el virus, para reproducirse, entra a la célula del individuo al que se ha introducido; durante este proceso de reproducción, partículas virales salen de la célula, infectando a otras células dentro del propio individuo y además, salen al exterior a través de las vías correspondientes según la característica del virus. De esta manera son transmitidas a otras personas. Este es el momento más peligroso de la interacción con el virus.Ocurre, sin embargo, que no hay una correspondencia entre la positividad de la prueba de PCR y este período peligroso del virus. El desconocimiento o el no tomar en cuenta este período de extracción del virus (virus shedding), puede dar lugar a falsos positivos, independientemente del porcentaje de sensibilidad o especificidad de la prueba. El 14 de agosto de 2020, CDC publicó en su página web su guía de aislamiento de pacientes con COVID-19 que se mantiene vigente hasta el día de hoy; esta está basada precisamente en los datos científicos que existen sobre la extracción viral (virus shedding)(36). Aquí, la CDC indica que las personas pueden seguir dando positivo hasta 3 meses después del diagnóstico y no ser infecciosas para los demás. Agrega que no es necesario hacer nuevas pruebas a alguien en los 3 meses posteriores a la infección inicial, a menos que esa persona presente los síntomas de COVID-19. En dicho informe la CDC refiere que se han publicado numerosos estudios nacionales e 

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^[2] Interpretación del resultado de la prueba de Ct 

Negativo: No hay valor de Ct o Ct es 40. 

Positivo: El valor de Ct <37, puede ser reportado como positivo. 

Sospechoso: El valor de Ct está entre 37-40. Se recomienda repetir el experimento. 

Si el valor Ct del resultado repetido es <40, la curva de amplificación tiene un pico significativo y la muestra se considera positiva, de lo contrario es negativa.

Consultado en: https://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html 

internacionales sobre la duración de la infección y la duración de la extracción viral (virus shedding). Informa también que los investigadores han descubierto que la cantidad de virus vivo en la nariz y la garganta cae significativamente poco después de que se desarrollen los síntomas de la COVID-19, y que la capacidad de las personas con COVID-19 de transmitirle la enfermedad a otra persona no es más de 10 días después del inicio de los síntomas y no más de 20 días en las personas con enfermedad grave o en aquellas que están gravemente inmunodeprimidas.

En un estudio publicado por Nature en mayo de 2021(37), se enfatiza en la importancia de comprender los factores y mecanismos que influyen en la propagación del virus infeccioso y el período durante el cual las personas infectadas con SARS-CoV-2 son contagiosas, para implementar las medidas correctas de salud pública con el fin de limitar la transmisión. Además, destacan la necesidad de la existencia de herramientas de diagnóstico para demostrar la presencia de virus infecciosos a partir de muestras de diagnóstico de rutina como es el caso de RT-PCR. Enfatizan que esta no distingue entre el virus competente para la replicación y el ARN residual. En ausencia de una prueba de diagnóstico más competente, la infecciosidad, a menudo, se establece utilizando otros recursos pues la RT-PCR es solo una herramienta útil para el diagnóstico inicial. Esto se debe a que, como dijimos, el ARN viral recogido por RT-PCR, sigue siendo detectable en ausencia de virus infeccioso.

Esto se vuelve aún más crítico si el protocolo de la prueba utilizada posee determinadas deficiencias como es el caso del protocolo Charité. Tal como establecimos en la sección anterior referente a las deficiencias técnico-biológicas de este protocolo, los cebadores utilizados (que no fueron verificados) poseen un número de posiciones inespecíficas que 

podrían generar, al diseñarse varias secuencias de cebadores, alternativas diferentes que no se relacionan con el SARS-CoV-2. Más recientemente, se han publicado trabajos donde se establece la diferencia entre el período de positividad de la prueba y el período de extracción viral (virus shedding), lo cual se siguió dando en las siguientes variantes del virus. La común conclusión es que los pacientes con COVID-19 completamente vacunados, con infección leve o asintomática, liberan el virus infeccioso en sus vías respiratorias superiores durante 6-9 días después del inicio o el diagnóstico de la enfermedad, incluso después de la resolución de los síntomas, pero no después del día 10. 

El análisis de este tema incluye un excelente metaanálisis que incluimos en las referencias(38,39). La determinación de estos tiempos para el SARS-CoV-2, han sido correlacionados en varios estudios, con el monto de carga viral existente que es potencialmente infecciosa. Uno de estos es el presentado por Wölfel y col.(40), donde, dicho sea de paso, también establecieron que el ARNm sub genómico viral se transcribe solo en células infectadas y no se empaqueta en viriones; por lo tanto, indica la presencia de células infectadas activamente en las muestras. Esto explica por qué un resultado de PCR positivo no es suficiente para probar infecciosidad, tal como habíamos discutido en párrafos anteriores.

Análisis epidemiológico general

Hemos presentado en este artículo evidencia científica de la existencia de falsos positivos atribuidos específicamente al protocolo de Charité que son debidos a la gran cantidad de deficiencias técnico-biológicas. Pero también nos hemos referido a otras causas de falsos positivos que son parte de la epidemiología molecular, tales como las atribuidas al comportamiento propio del virus, así como las características inherente a la propia prueba, en relación con la persistencia del período de positividad. Este es el caso de lo discutido en cuanto a la extracción viral (virus shedding) lo cual, independientemente de la calidad de la prueba en sí, muchas veces no es tomado en cuenta. Nos quedan aún dos aspectos importantes que discutir sobre la existencia de falsos positivos, cosa que haremos en esta sección. Estos son, el relacionado a entornos de baja prevalencia viral, y el relacionado a lo conocido como “procedimientos operativos estándar” (SOP). Ambos aspectos son parte de la epidemiol0gía general; el primero, conlleva un componente biológico, mientras que el segundo, posee un componente técnico-administrativo.

La existencia de falsos positivos en las pruebas de PCR es negada furibundamente por aquellos que dicen que hay que seguir la ciencia, a pesar de que hay innumerable cantidad de estudios serios, revisados por pares, que se refieren a esto, aún desde antes de la existencia del COVID-19. Además de los mencionados con anterioridad, existen otras causas de falsos positivos como es el caso de los ocurridos cuando se realizan pruebas de PCR en un entorno de baja prevalencia viral. Todo proceso de investigación comprende varias etapas que van desde el nivel exploratorio, pasando por nivel experimental y explicativo, terminando en el nivel aplicativo; las primeras, son etapas de laboratorio; la última etapa se realiza en el mundo real que es la comunidad. Lo que usualmente se utiliza es el valor teórico, obtenido en etapas anteriores de la investigación, lo cual crea gran cantidad de sobrediagnósticos, con las nocivas consecuencias que esto conlleva. 

Las validaciones técnicas iniciales de los nuevos ensayos de diagnóstico, cuando se hacen debidamente, solo reflejan el proceso de trabajo de laboratorio de una manera parcial. Todavía peor cuando se dan casos en que no se hacen estas validaciones preliminares, como, aparentemente, fue el caso del protocolo de Charité. En el caso de la determinación del verdadero estimado de falsos positivos de las pruebas de PCR, esto está relacionado directamente con las estimaciones de la especificidad y del indicador epidemiológico denominado “valor predictivo positivo” (PPV)(41). Estos se calculan en esta última etapa del proceso de investigación que corresponde al llamado nivel aplicativo. Estos dos valores son indicadores epidemiológicos que muestran la eficacia real de una prueba diagnóstica que, en este caso, son las pruebas de RT-qPCR; estas, como hemos dicho, se miden en condiciones reales en la comunidad y dan la probabilidad de que el resultado de la prueba sea realmente positivo o negativo; por consiguiente, estas evaluaciones se hacen después de tener el resultado inicial. 

Estos indicadores muestran cómo se desenvuelve esta prueba diagnóstica cuya eficacia ha sido definida inicialmente por la sensibilidad y especificidad que, como también hemos dicho, se deben determinar teóricamente (in vitro), en las fases iniciales de la investigación. El valor de estos índices varía de acuerdo con la prevalencia de la enfermedad en la población(42). Estos índices se determinan a través de la incorporación de los resultados de las mediciones en las denominadas “tablas de contingencia”(43). En etapas iniciales y finales de una epidemia, la infección tiene una prevalencia relativamente baja; en estas condiciones, sabemos por la epidemiología que hay una mayor probabilidad de presentación de falsos positivos mostradas por las pruebas diagnósticas pues el PPV aumenta(44). Al mismo tiempo, la capacidad operativa para la toma de muestras y la realización de la prueba está aumentada como consecuencia de: reclutamiento masivo de personal que se ha ido acumulando, la obtención gradual de recursos, etc. En estos entornos, muchos de los que se someten a las pruebas estarán libres de infección. Esto, sumado a las deficiencias mencionadas de la prueba, preparó el camino hacia la existencia de gran cantidad de falsos positivos.

En términos generales, esto se vuelve crítico cuando las pruebas diagnósticas se hacen en un entorno en que la prevalencia de la infección es baja y, especialmente, cuando estas se hacen de manera masiva como fue el caso del COVID-19, especialmente en sus inicios en que existió una gran capacidad operativa. En el siguiente extracto obtenido del sitio web de la OMS, se refleja la estrategia de esta institución sobre la enfermedad, al inicio de la epidemia, dada por su propio director y que contribuyó grandemente a una asistencia masiva de la población a la toma de la muestra para la prueba(45):

Tenemos un mensaje simple para todos los países: prueba, prueba, prueba.

Examina todos los casos sospechosos.

Si dan positivo, aíslalos y averigua con quién han estado en contacto cercano hasta 2 días antes de desarrollar los síntomas, y haz la prueba a esas personas también.

Cada día, se producen más pruebas para satisfacer la demanda mundial.

La OMS ha enviado casi 1,5 millones de pruebas a 120 países. Estamos trabajando con empresas para aumentar la disponibilidad de pruebas para los más necesitados.

Notemos en este extracto que el director de la OMS enfatiza en dos cosas: hacer muchas pruebas y que se estaban enviando masivamente pruebas a todos lados. 

Estamos completamente seguros de que todos recordamos las inmensas colas de personas en todas partes del mundo, abarrotando los múltiples lugares públicos y privados donde se realizaban estas pruebas sin que existiera el debido monitoreo de la persona para establecer la necesidad de la realización de esta. En nuestra ciudad, en el Sur de la Florida, incluso había múltiples puntos de los denominados ¨drive-in” en que podían tomarse las muestras desde el automóvil. El terror creado, pronto llevó a una gran parte de la humanidad a hacerse sus pruebas diagnósticas, aún sin tener síntomas y sin haber incurrido en algún tipo de riesgo epidemiológico. 

Inclusive muchos se las realizaban frecuente y constantemente. El mundo había entrado en una histeria colectiva; muy pronto, el realizarse la prueba se convirtió en una especie de catarsis para la gente. Nuestros recuerdos son la mejor referencia que certifica que esta histeria se dio a todo lo largo de la epidemia; se dio desde el principio de esta y persistió por mucho tiempo, hasta el año 2021 y en algunos casos, hasta el 2022, cuando casi todo el mundo, o se había inoculado con la substancia infectante o le había dado la enfermedad. En otras palabras, en épocas tanto de alta como de baja prevalencia.

Jordan P. Skittrall y col.(46), realizaron un estudio con un número grande de muestras de pacientes, concluyendo que, cuando la prevalencia es baja, una proporción significativa de los resultados inicialmente positivos resultan ser falsos positivos al hacerse las pruebas de confirmación. Esto, tal como afirman los autores, causa un aislamiento comunitario y un rastreo de contactos innecesarios. Por otro lado, aquellos diagnosticados falsamente positivos corren el riesgo de que, en caso de ser hospitalizados, pueden quedar en contacto con pacientes infecciosos. Adicionalmente, estos resultados falsos positivos sobre estiman las tasas de infección, lo cual tiene consecuencias epidemiológicas graves. De aquí la importancia de una interpretación correcta de los resultados de las pruebas(47)

Healy y col.(48), calcularon el valor predictivo positivo (PPV) en una comunidad con una prevalencia baja de la enfermedad, para medir los resultados de una prueba que, según los autores, Public Health Inglaterra, de acuerdo con los ensayos de RT-PCR, reportaba una especificidad de 95% y que, por lo tanto, teóricamente, debía tener un 5% de falsos positivos. El PPV obtenido en el estudio fue de 16%. Recordemos que esta prueba determina la verdadera probabilidad de la existencia de un falso positivo. Seguidamente, estos evaluaron las implicaciones clínicas de los resultados falsos positivos en un área poblacional con baja prevalencia. Encontraron que las repercusiones producidas por estos falsos resultados positivos dieron lugar a retiros de pacientes en lista de espera de trasplantes durante 2 semanas. A algunos de los pacientes examinados preoperatorios se les retrasó la cirugía. A los pacientes examinados, antes de darles de alta, los mantuvieron en el hospital, en muchos casos, innecesariamente, con los riesgos que esto implica.

Otro hallazgo importante del estudio fue que, aunque en un menor impacto, los falsos resultados positivos en entornos de alta prevalencia no dejan de producir repercusiones; estas son muy similares a las consecuencias encontradas en los entornos de baja prevalencia. En estos entornos, el porcentaje general de pruebas falsamente positivas no cambia; las pruebas aumentan como consecuencia de la alta prevalencia, pero el número absoluto de falsos positivos también aumenta. Los autores consideraron que el COVID-19 representa un reto muy particular porque la prevalencia de la enfermedad va cambiando en tiempo real y en línea con las medidas de prevención lo cual afecta grandemente, tanto las estrategias en cuanto a tomas de muestras como la interpretación de los resultados. Finalmente, concluyeron que, tanto la posibilidad de falsos positivos como de falsos negativos, deben tenerse en cuenta, puesto que, en entornos de alta prevalencia, los resultados falsos negativos serán proporcionalmente un mayor problema. Por el contrario, en entornos de baja prevalencia, los falsos resultados positivos son proporcionalmente mayores.

Análisis epidemiológico de orden técnico-administrativo

El otro aspecto importante, causante de falsos positivos, que nos queda por discutir es el relacionado a lo conocido como “buenas prácticas de laboratorio” (GLP). La Agencia Europea de Medicina la define como conjunto de reglas y criterios para un sistema de calidad relacionado con el proceso organizativo y las condiciones en las que se planifican, realizan, supervisan, registran, informan y archivan los estudios no clínicos de salud y seguridad ambiental(49). De acuerdo con la OECD (Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo), uno de los propósitos fundamentales de los Principios de Buenas Prácticas de Laboratorio es garantizar la calidad y la integridad de los datos de prueba relacionados con los estudios de seguridad no clínicos. Y el propósito principal es tener confianza en la calidad, la integridad de los datos y poder reconstruir las actividades realizadas durante la realización de estudios de seguridad no clínicos(50). 

Como tal, entonces, esto debe ser considerado como un aspecto de orden técnico-administrativo o gerencial pues está muy relacionado al grado de organización en los laboratorios y con el entrenamiento del personal (en su relación con la calidad). Los gobiernos del Reino Unido y de los Estados Unidos, a través de la Administración de Drogas y Alimentos, etc., proveen información y monitoreos sobre GLP(51,52). Es, precisamente, por las regulaciones internacionales de calidad, que uno de los requisitos fundamentales para la GLP es contar con lo conocido como “procedimientos operativos estándar” (SOP). Esto es definido por la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH), en su sección de glosario en el punto 1.55, como instrucciones escritas detalladas para lograr la uniformidad del desempeño de una función específica(53). Este proceso escrito permite que se desarrolle un procedimiento científico, de la misma manera, cada vez que se completa.

La importancia de esto la podemos constatar en base a una experiencia muy amarga que vivimos en el año 2001 cuando nos correspondió, como director general de salud, coordinar la investigación relacionada a una sobre radiación de pacientes del Instituto Oncológico de Panamá que produjo varias muertes, y cuyo resultado presentamos personalmente ante la Organización Internacional de Energía Atómica (OIEA) con sede en Austria. Al margen de todas las explicaciones técnicas dadas por los expertos, la explicación sencilla de la tragedia ocurrida fue simplemente, la ausencia de un SOP para la irradiación de pacientes. Esta ausencia dio margen a que los procedimientos para calcular las dosis de irradiación de los pacientes fueran sujetos a variaciones por los médicos-físicos tratantes; esto, combinado con el hecho de que las máquinas que aplicaban el tratamiento no estaban diseñadas para interpretar correctamente estas variaciones, dieron origen a la tragedia.

Poco antes de la publicación del protocolo Charité, se diseñó un cuestionario para evaluar la capacidad, la calidad y las especificaciones operativas, relacionadas con el diagnóstico de 2019-nCoV, así como las barreras contra su implementación, en laboratorios que forman parte de la red europea de laboratorios expertos en enfermedades virales emergentes. Esta está asociada al Centro Europeo para el Control y la Prevención de Enfermedades y la Red Europea de Laboratorios de Referencia para la Gripe Humana. En otras palabras, se hizo una evaluación de las GLP de los laboratorios que, como está establecido, deben incluir un SOP.  

La lectura del informe de los resultados del cuestionario(54) nos muestra que fueron evaluados los siguientes aspectos: capacidad para el diagnóstico molecular del nuevo coronavirus; experiencia para el coronavirus y otros patógenos respiratorios; nivel de bioseguridad; aspectos específicos sobre la prueba; nivel de validación de especificidad, y existencia o no de control positivo. 

Loa resultados no demostraron una evaluación completa de los aspectos sobre buenas prácticas de laboratorio. Lo único que encontramos sobre esto en el informe, fue la mención de que tenían limitaciones en horas-profesionales, y se necesitaban verificaciones de capacidad basadas en la realización de paneles de competencia. Mencionan también que, en general, sufrían de problemas estructurales. Sin embargo, no se da mayor detalle sobre estos aspectos y desconocemos si otras áreas, como la existencia de SOP fue evaluada. Sin embargo, sobre este tema, es muy importante mencionar que, en un estudio realizado por Braunstein y col., se describieron numerosas causas de falsos positivos que tienen que ver con estos problemas de índole técnico-administrativos relacionados con aspectos de calidad, algunos de los cuales fueron los siguientes(42):

• Problemas de contaminación (por ejemplo, durante el muestreo; durante la producción de reactivos de laboratorio; contaminación del equipo por muestras de alto título viral, etc.).
• Errores de entrada o transmisión de datos (por ejemplo, problemas en el software, mala tabulación, etc.).
• Comunicar mal los resultados.
• Variaciones en los parámetros de medición (ejemplo, niveles de detección de la muestra, definición de un resultado indeterminado, etc.).  

Cabe agregar, finalmente, que un buen SOP debe incluir la definición de controles y validaciones apropiadas para que una prueba molecular sea robusta; pero, como ya discutimos con anterioridad, esto no se publicó en el protocolo Charité, y como también comentamos, aún no se han publicado.

Comentarios finales

Hemos discutido en este artículo las deficiencias del protocolo Charité de los europeos que llevaron a un sobrediagnóstico de la enfermedad. Dado que, por ser el primer protocolo desarrollado fuera de China, fue el que se utilizó en el principio de este evento de salud en toda Europa y la mayor parte del mundo, excepto en China. Los que no usaron este protocolo de los europeos en particular, confeccionaron su propio protocolo en base a este. Aunque posteriormente se fueron desarrollando nuevos protocolos en otras partes del mundo, como, por ejemplo, en los Estados Unidos, donde se corrigieron algunas de estas deficiencias, en especial en lo relacionado a los genes target(26), ya el daño estaba hecho y la gran cantidad de sobrediagnósticos fue un factor de importancia en la transformación de este evento de salud en una pandemia de grandes proporciones.

El análisis de este protocolo en particular y, en general, de las técnicas de RT-qPCR, revela que, en realidad, esta no puede ser considerada como un estándar de oro para el diagnóstico de esta enfermedad viral pues hay gran cantidad de limitaciones: técnico biológicas, epidemiológicas y técnico administrativas que producen muchas deficiencias en su capacidad diagnóstica. Sorprende mucho que, siendo esto un principio básico conocido, haya sido obviado sistemáticamente por personas como la Dra. Koopmans, coautora del informe Corman-Dresten, y el Dr. Anthony Pauci, quienes incluso se habían manifestado públicamente sobre estas deficiencias(55,56). 

Sin embargo, las pruebas masivas por RT-qPCR se convirtieron en la estrategia establecida por el propio director de la OMS, tal como referenciamos en una sección anterior. Esto, obviamente, produjo un sobre diagnóstico de la enfermedad que no solo distorsionó el seguimiento epidemiológico de la enfermedad, con las consecuencias que esto generó, sino que se justificaron medidas que se transformaron, a su vez, en un mayor sufrimiento para la humanidad entera. 

En todos nuestros años como profesional de la salud, especialmente como epidemiólogo y, como tal, vinculado a los sistemas de información en salud, y como autoridad de salud, nunca habíamos visto la rapidez y supuesta eficiencia en la publicación de los casos y muertes de la enfermedad; esto se hizo, literalmente, en tiempo real; esto no es posible. La veracidad de esto no es posible pues es necesario pasar por un sistema de verificación de los diagnósticos; menos aun cuando esto se hizo basado en una prueba que, como hemos visto, posee gran cantidad de falencias.

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55.      Koopmans M in Podcast from November 26th 2020. Available online: [Internet]. [cited 2023 Jun 7]. BREAKING: PCR Test van de baan! (EN DE NL subtitles included) – YouTube. comenar en 00:09 min. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=flsF7trvq2c

56.      Fauci A. In TV interview from December 30th 2021. Available online: [Internet]. [cited 2023 Jun 7]. Covid Tests Don’t Do What You Think They Do, Dr. Fauci Explains – YouTube. comenzar en 06:35 min. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=bAICMQ1D5F8